RESUMO
Cucumber mosaic virus (CMV) is a tremendous threat to vegetables across the globe, including in Pakistan. The present work was conducted to investigate the genetic variability of CMV isolates infecting pea and spinach vegetables in the Pothwar region of Pakistan. Serological-based surveys during 2016-2017 revealed 31.70% overall CMV disease incidence from pea and spinach crops. Triple-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA) revealed that all the positive isolates belong to CMV subgroup II. Two selected cDNA from ELISA-positive samples representing each pea and spinach crops were PCR-amplified (ca.1100 bp) and sequenced corresponding to the CMV CP gene which shared 93.7% nucleotide identity with each other. Both the sequences of CMV pea (AAHAP) and spinach (AARS) isolates from Pakistan were submitted to GenBank as accession nos. MH119071 and MH119073, respectively. BLAST analysis revealed 93.4% sequence identity of AAHAP isolate with SpK (KC763473) from Iran while AARS isolate shared maximum identity (94.5%) with the strain 241 (AJ585519) from Australia and clustered with some reference isolates of CMV subgroup II from UK (Z12818) and USA (AF127976) in a Neighbour joining phylogenetic reconstruction. A total of 59 polymorphic (segregating) sites (S) with nucleotide diversity (π) of 0.06218 was evident while no INDEL event was observed in Pakistani isolates. The evolutionary distance of Pakistani CMV isolates was recorded as 0.0657 with each other and 0.0574-0.2964 with other CMV isolates reported elsewhere in the world. A frequent gene flow (Fst = 0.30478 <0.33) was observed between Pakistani and earlier reported CMV isolates. In genetic differentiation analysis, the value of three permutation-based statistical tests viz; Z (84.3011), Snn (0.82456), and Ks* (4.04042) were non-significant. The statistical analysis revealed the [...].
Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) é uma tremenda ameaça aos vegetais em todo o mundo, inclusive no Paquistão. O presente trabalho foi conduzido para investigar a variabilidade genética de isolados de CMV infectando vegetais de ervilha e espinafre na região de Pothwar, Paquistão. Pesquisas com base em sorologia durante 2016-2017 revelaram 31,70% da incidência geral da doença por CMV em safras de ervilha e espinafre. O ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche de anticorpo triplo (TAS-ELISA) revelou que todos os isolados positivos pertencem ao subgrupo II do CMV. Dois cDNA selecionados de amostras positivas para ELISA representando cada safra de ervilha e espinafre foram amplificados por PCR (ca.1100 pb) e sequenciados correspondendo ao gene CMV CP que compartilhou 93,7% de identidade de nucleotídeo um com o outro. Ambas as sequências de isolados de ervilha CMV (AAHAP) e espinafre (AARS) do Paquistão foram submetidas ao GenBank como nos de acesso. MH119071 e MH119073, respectivamente. A análise BLAST revelou 93,4% de identidade de sequência do isolado AAHAP com SpK (KC763473) do Irã, enquanto o isolado AARS compartilhou a identidade máxima (94,5%) com a cepa 241 (AJ585519) da Austrália e agrupada com alguns isolados de referência do subgrupo II de CMV do Reino Unido (Z12818) e EUA (AF127976) em uma reconstrução filogenética vizinha. Um total de 59 sítios polimórficos (segregantes) (S) com diversidade de nucleotídeos (π) de 0,06218 foi evidente, enquanto nenhum evento INDEL foi observado em isolados do Paquistão. A distância evolutiva de isolados de CMV do Paquistão foi registrada como 0,0657 entre si e 0,0574-0,2964 com outros isolados de CMV relatados em outras partes do mundo. Um fluxo gênico frequente (Fst = 0,30478 < 0,33) foi observado entre os isolados de CMV do Paquistão e relatados anteriormente. Na análise de diferenciação genética, os valores de três testes estatísticos baseados em [...].
Assuntos
Animais , Bromoviridae/genética , Bromoviridae/patogenicidade , Ervilhas/virologia , Spinacia oleracea/virologiaRESUMO
Abstract Cucumber mosaic virus (CMV) is a tremendous threat to vegetables across the globe, including in Pakistan. The present work was conducted to investigate the genetic variability of CMV isolates infecting pea and spinach vegetables in the Pothwar region of Pakistan. Serological-based surveys during 2016-2017 revealed 31.70% overall CMV disease incidence from pea and spinach crops. Triple-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA) revealed that all the positive isolates belong to CMV subgroup II. Two selected cDNA from ELISA-positive samples representing each pea and spinach crops were PCR-amplified (ca.1100 bp) and sequenced corresponding to the CMV CP gene which shared 93.7% nucleotide identity with each other. Both the sequences of CMV pea (AAHAP) and spinach (AARS) isolates from Pakistan were submitted to GenBank as accession nos. MH119071 and MH119073, respectively. BLAST analysis revealed 93.4% sequence identity of AAHAP isolate with SpK (KC763473) from Iran while AARS isolate shared maximum identity (94.5%) with the strain 241 (AJ585519) from Australia and clustered with some reference isolates of CMV subgroup II from UK (Z12818) and USA (AF127976) in a Neighbour-joining phylogenetic reconstruction. A total of 59 polymorphic (segregating) sites (S) with nucleotide diversity () of 0.06218 was evident while no INDEL event was observed in Pakistani isolates. The evolutionary distance of Pakistani CMV isolates was recorded as 0.0657 with each other and 0.0574-0.2964 with other CMV isolates reported elsewhere in the world. A frequent gene flow (Fst = 0.30478 0.33) was observed between Pakistani and earlier reported CMV isolates. In genetic differentiation analysis, the value of three permutation-based statistical tests viz; Z (84.3011), Snn (0.82456), and Ks* (4.04042) were non-significant. The statistical analysis revealed the values 2.02535, 0.01468, and 0.71862 of Tajima's D, Fu, & Lis F* and D* respectively, demonstrating that the CMV population is under balancing selection.
Resumo Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) é uma tremenda ameaça aos vegetais em todo o mundo, inclusive no Paquistão. O presente trabalho foi conduzido para investigar a variabilidade genética de isolados de CMV infectando vegetais de ervilha e espinafre na região de Pothwar, Paquistão. Pesquisas com base em sorologia durante 2016-2017 revelaram 31,70% da incidência geral da doença por CMV em safras de ervilha e espinafre. O ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche de anticorpo triplo (TAS-ELISA) revelou que todos os isolados positivos pertencem ao subgrupo II do CMV. Dois cDNA selecionados de amostras positivas para ELISA representando cada safra de ervilha e espinafre foram amplificados por PCR (ca.1100 pb) e sequenciados correspondendo ao gene CMV CP que compartilhou 93,7% de identidade de nucleotídeo um com o outro. Ambas as sequências de isolados de ervilha CMV (AAHAP) e espinafre (AARS) do Paquistão foram submetidas ao GenBank como nos de acesso. MH119071 e MH119073, respectivamente. A análise BLAST revelou 93,4% de identidade de sequência do isolado AAHAP com SpK (KC763473) do Irã, enquanto o isolado AARS compartilhou a identidade máxima (94,5%) com a cepa 241 (AJ585519) da Austrália e agrupada com alguns isolados de referência do subgrupo II de CMV do Reino Unido (Z12818) e EUA (AF127976) em uma reconstrução filogenética vizinha. Um total de 59 sítios polimórficos (segregantes) (S) com diversidade de nucleotídeos () de 0,06218 foi evidente, enquanto nenhum evento INDEL foi observado em isolados do Paquistão. A distância evolutiva de isolados de CMV do Paquistão foi registrada como 0,0657 entre si e 0,0574-0,2964 com outros isolados de CMV relatados em outras partes do mundo. Um fluxo gênico frequente (Fst = 0,30478 0,33) foi observado entre os isolados de CMV do Paquistão e relatados anteriormente. Na análise de diferenciação genética, os valores de três testes estatísticos baseados em permutação viz, Z (84,3011), Snn (0,82456) e Ks * (4,04042) não foram significativos. A análise estatística revelou os valores 2,02535, 0,01468 e 0,71862 de Tajimas D, Fu, & Lis F * e D * respectivamente, demonstrando que a população de CMV está sob seleção de balanceamento.
RESUMO
Abstract Cucumber mosaic virus (CMV) is a tremendous threat to vegetables across the globe, including in Pakistan. The present work was conducted to investigate the genetic variability of CMV isolates infecting pea and spinach vegetables in the Pothwar region of Pakistan. Serological-based surveys during 2016-2017 revealed 31.70% overall CMV disease incidence from pea and spinach crops. Triple-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA) revealed that all the positive isolates belong to CMV subgroup II. Two selected cDNA from ELISA-positive samples representing each pea and spinach crops were PCR-amplified (ca.1100 bp) and sequenced corresponding to the CMV CP gene which shared 93.7% nucleotide identity with each other. Both the sequences of CMV pea (AAHAP) and spinach (AARS) isolates from Pakistan were submitted to GenBank as accession nos. MH119071 and MH119073, respectively. BLAST analysis revealed 93.4% sequence identity of AAHAP isolate with SpK (KC763473) from Iran while AARS isolate shared maximum identity (94.5%) with the strain 241 (AJ585519) from Australia and clustered with some reference isolates of CMV subgroup II from UK (Z12818) and USA (AF127976) in a Neighbour-joining phylogenetic reconstruction. A total of 59 polymorphic (segregating) sites (S) with nucleotide diversity (π) of 0.06218 was evident while no INDEL event was observed in Pakistani isolates. The evolutionary distance of Pakistani CMV isolates was recorded as 0.0657 with each other and 0.0574-0.2964 with other CMV isolates reported elsewhere in the world. A frequent gene flow (Fst = 0.30478 <0.33) was observed between Pakistani and earlier reported CMV isolates. In genetic differentiation analysis, the value of three permutation-based statistical tests viz; Z (84.3011), Snn (0.82456), and Ks* (4.04042) were non-significant. The statistical analysis revealed the values 2.02535, 0.01468, and 0.71862 of Tajima's D, Fu, & Li's F* and D* respectively, demonstrating that the CMV population is under balancing selection.
Resumo Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) é uma tremenda ameaça aos vegetais em todo o mundo, inclusive no Paquistão. O presente trabalho foi conduzido para investigar a variabilidade genética de isolados de CMV infectando vegetais de ervilha e espinafre na região de Pothwar, Paquistão. Pesquisas com base em sorologia durante 2016-2017 revelaram 31,70% da incidência geral da doença por CMV em safras de ervilha e espinafre. O ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche de anticorpo triplo (TAS-ELISA) revelou que todos os isolados positivos pertencem ao subgrupo II do CMV. Dois cDNA selecionados de amostras positivas para ELISA representando cada safra de ervilha e espinafre foram amplificados por PCR (ca.1100 pb) e sequenciados correspondendo ao gene CMV CP que compartilhou 93,7% de identidade de nucleotídeo um com o outro. Ambas as sequências de isolados de ervilha CMV (AAHAP) e espinafre (AARS) do Paquistão foram submetidas ao GenBank como nos de acesso. MH119071 e MH119073, respectivamente. A análise BLAST revelou 93,4% de identidade de sequência do isolado AAHAP com SpK (KC763473) do Irã, enquanto o isolado AARS compartilhou a identidade máxima (94,5%) com a cepa 241 (AJ585519) da Austrália e agrupada com alguns isolados de referência do subgrupo II de CMV do Reino Unido (Z12818) e EUA (AF127976) em uma reconstrução filogenética vizinha. Um total de 59 sítios polimórficos (segregantes) (S) com diversidade de nucleotídeos (π) de 0,06218 foi evidente, enquanto nenhum evento INDEL foi observado em isolados do Paquistão. A distância evolutiva de isolados de CMV do Paquistão foi registrada como 0,0657 entre si e 0,0574-0,2964 com outros isolados de CMV relatados em outras partes do mundo. Um fluxo gênico frequente (Fst = 0,30478 < 0,33) foi observado entre os isolados de CMV do Paquistão e relatados anteriormente. Na análise de diferenciação genética, os valores de três testes estatísticos baseados em permutação viz, Z (84,3011), Snn (0,82456) e Ks * (4,04042) não foram significativos. A análise estatística revelou os valores 2,02535, 0,01468 e 0,71862 de Tajima's D, Fu, & Li's F * e D * respectivamente, demonstrando que a população de CMV está sob seleção de balanceamento.
Assuntos
Cucumovirus/genética , Cucumis sativus , Paquistão , Filogenia , Doenças das Plantas , Variação Genética , Spinacia oleracea , ErvilhasRESUMO
Nos últimos anos, vegetais têm sido responsáveis por surtos de enfermidades transmitidas por alimentos (ETA) em diversas regiões do mundo por serem veículos dos mais diferentes micro-organismos patogênicos, entre eles Salmonella spp, Listeria monocytogenes e Escherichia coli produtora de toxina de Shiga (STEC). O uso de sanitizantes nem sempre reduz de maneira significativa a população de micro-organismos presentes nos vegetais, sendo necessária a aplicação de técnicas mais eficientes, entre elas, a radiação gama. Assim, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito da irradiação na redução de STEC, Salmonella spp. e L. monocytogenes inoculadas em espinafre minimamente processado, bem como sobre os atributos físico-químicos e sensoriais do vegetal. Amostras de espinafre (Tetragonia expansa) foram inoculadas com um "pool" de cepas de Salmonella spp, um "pool" de cepas de L. monocytogenes e um "pool" de cepas de STEC, separadamente, e expostas às doses de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 kGy. Os valores de D10 para Salmonella spp, L. monocytogenes e STEC foram, respectivamente, 0,19 a 0,20 kGy, 0,20 a 0,21 kGy e 0,17 kGy. Foram avaliados os comportamentos de Salmonella spp, L. monocytogenes e STEC em amostras de espinafre expostas à doses cinco vezes maiores do que o valor D10 obtido para cada micro-organismo: 1,0; 1,05 e 0,85 kGy, respectivamente, e em amostras não irradiadas armazenadas por 12 dias a (4±1) °C e a (10±1) °C. Os resultados mostram que as doses empregadas reduziram a população de Salmonella e de STEC em aproximadamente 6 ciclos log no dia zero tendo permanecido abaixo do limite de detecção (<10 UFC/g), mesmo após 12 dias de armazenamento em ambas as temperaturas. A dose de 1,05 kGy reduziu a população de L. monocytogenes em, aproximadamente, 5 log imediatamente após a irradiação, porém com recuperação de 2,62 log nas amostras armazenadas a (10±1) °C ao final do período de armazenamento. Amostras de espinafre expostas às doses de 1 e 1,5 kGy e a amostra-controle, mantidas sob refrigeração (4±1) ºC, foram utilizadas para a avaliação da vida de prateleira (VP), análise sensorial, análise de cor, determinação de ácido ascórbico, flavonoides, compostos fenólicos e capacidade antioxidante. A VP da amostra exposta à dose de 1 kGy foi de 15 dias, dois dias a mais que a da amostra-controle, enquanto a exposta a 1,5 kGy apresentou VP de 12 dias. Todas as amostras expostas à radiação foram aceitas pelos provadores. A irradiação não provocou alterações significativas na concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante, porém houve alteração na cor e na concentração de flavonoides. As estações do ano, por sua vez, tiveram influência sobre a coloração, concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante. Apesar da alteração na coloração ter sido observada na análise instrumental, esta não foi percebida pelos provadores durante a análise sensorial. O processo de irradiação mostrou ser uma boa alternativa para aumentar a segurança microbiológica de espinafre sem alterar as características sensoriais. No entanto, o uso das Boas Práticas de Fabricação nunca deve ser negligenciado
In recent years, fresh produce have been responsible for foodborne disease outbreaks worldwide, due to their contamination by different pathogenic microorganisms such as Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). The use of sanitizers does not always significantly reduce the microbial populations present in vegetables, and thus, the application of more efficient techniques such as gamma radiation, is required. The objectives of this study were to evaluate the effect of irradiation on the reduction of the populations of STEC, Salmonella spp. and L. monocytogenes, inoculated on minimally processed spinach, as well as to assess its effect on the sensory and physicochemical characteristics of the vegetable. Spinach (Tetragonia expansa) samples were individually inoculated, with a cocktail of three strains of Salmonella spp, three strains of L. monocytogenes and three strains of STEC and exposed to doses of 0, 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 and 1.0 kGy. The D10 values determined in this study ranged from 0.19 to 0.20 kGy for Salmonella spp, 0.20 to 0.21 kGy for L. monocytogenes, and 0.17 kGy for STEC. The behavior of Salmonella spp., L. monocytogenes and STEC were evaluated in spinach samples exposed to doses of 1.0, 1.05 and 0.85 kGy, respectively, and in non-irradiated samples, stored for 12 days at (4±1) °C and (10±1) °C. The results showed that the populations of Salmonella and STEC were reduced at about 6 log, on day zero, and remained below the detection limit (<10 CFU/g) even after 12 days of storage at both temperatures tested. The 1.05 kGy dose reduced the population of L. monocytogenes in approximately 5 log, but in the samples stored at (10±1) °C, the growth of the microorganism (2,62 log) was observed at the end of the storage time. Spinach samples exposed to 1 and 1.5 kGy, as well as the control sample, all kept under refrigeration (4±1) °C were used for the evaluation of the product shelf life, sensory analysis, color analysis, determination of ascorbic acid, flavonoids, phenolic compounds and the antioxidant capacity. The samples exposed to 1 kGy displayed a shelf life of 15 days, two days longer than that observed for the control sample, while those exposed to 1.5 kGy showed a shelf life of 12 days. All samples exposed to radiation were accepted by the sensorial panel. The irradiation had no significant effect either on the concentration of phenolic compounds or on the antioxidant activity. Nevertheless, there was a reduction in the concentration of flavonoids and change on the color. The color, phenolic compounds concentration and antioxidant activity were influenced by the seasons of the year. Although the change in color was observed by instrumental analysis, this was not perceived by the panelists during sensory analysis. The irradiation process is a great alternative for microbiological safety purpose together with Good Manufacturing Practices
